ProteanFect CRISPR Ultra 轉(zhuǎn)染試劑盒使用說明

產(chǎn)品簡(jiǎn)介

ProteanFect CRISPR Ultra 轉(zhuǎn)染試劑盒專為難轉(zhuǎn)細(xì)胞系的基因編輯設(shè)計(jì)，采用自組裝蛋白納米顆粒技術(shù)，屬于非病毒、非電轉(zhuǎn)、非脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑。其通過高效遞送 RNP（Cas9 蛋白與 guide RNA）至細(xì)胞內(nèi)，實(shí)現(xiàn)安全、高精度的基因編輯。

試劑盒儲(chǔ)存與成分說明

試劑盒通過干冰運(yùn)輸，收到后需立即存放于 -80℃。各組分存儲(chǔ)條件如下：

• Reagent A（PT07）：開封后保存于 2-8℃。

• Reagent B（PT07）：保存于 -20℃，避免反復(fù)凍融。

• Cas9 蛋白（1 µg/µL）：保存于 -80℃，避免反復(fù)凍融。

• EGFP mRNA（1 µg/µL）陽(yáng)性對(duì)照：保存于 -80℃，用于驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率。

• Human TRAC-sgRNA（1 µg/µL）陽(yáng)性對(duì)照：保存于 -80℃，靶向序列為 TGTGCTAGACATGAGGTCTA。

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實(shí)驗(yàn)前材料準(zhǔn)備

• 待轉(zhuǎn)染細(xì)胞：活性需 > 90%，推薦使用生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞。

• 培養(yǎng)基：Opti-MEM 或無(wú)血清培養(yǎng)基（如 RPMI 1640、DMEM），使用前預(yù)熱至室溫。

• 轉(zhuǎn)染試劑：室溫解凍后顛倒混勻，確保溶液均一。

• 其他材料：完·全培養(yǎng)基、無(wú)菌 EP 管、待轉(zhuǎn)染的核酸樣品。

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操作步驟（以 96 孔板為例）

1. 配置轉(zhuǎn)染體系（全程冰上操作）

• 步驟 1.1：在 40 µL Reagent A 中加入 0.8 µg（約 5 pmol）Cas9 蛋白和 0.3 µg（約 10 pmol）sgRNA，充分混勻。

• 步驟 1.2：加入 1.4 µL Reagent B，移液槍吹打 20-30 次或渦旋 10 秒混勻。

2. 細(xì)胞處理

• 懸浮細(xì)胞：離心（300 g，5 分鐘）棄上清，用 Opti-MEM 重懸至濃度 5×10? - 1×10? cells/mL。

• 貼壁細(xì)胞：轉(zhuǎn)染前匯合率保持 50%-80%，用 Opti-MEM 輕柔清洗兩次，每孔加入 20 µL Opti-MEM 備用。

3. 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

• 步驟 3.1：將轉(zhuǎn)染體系與 20 µL 細(xì)胞懸液混合（貼壁細(xì)胞直接加入孔板）。

• 步驟 3.2：37℃ 孵育 45-60 分鐘（部分細(xì)胞可延長(zhǎng)至 2 小時(shí)）。

• 步驟 3.3：加入 200 µL 完·全培養(yǎng)基終止反應(yīng)，離心棄上清（貼壁細(xì)胞直接換液）。

• 步驟 3.4：繼續(xù)培養(yǎng) 72 小時(shí)后檢測(cè)基因編輯效率。

注意事項(xiàng)：

• 轉(zhuǎn)染體系若出現(xiàn)輕微粘稠屬正常現(xiàn)象，需置于冰上或 30 分鐘內(nèi)使用。

• EGFP mRNA 陽(yáng)性對(duì)照操作：步驟 1.1 中加入 0.5 µg EGFP mRNA，其余步驟相同，轉(zhuǎn)染后 5-48 小時(shí)觀察熒光表達(dá)。

不同孔板規(guī)格的組分用量推薦

• 96 孔板：Reagent A 40 µL，Cas9 蛋白 0.8 µg，sgRNA 0.3 µg，Reagent B 1.4 µL，細(xì)胞數(shù) 1×10? - 2×10?（20 µL 懸液）。

• 48 孔板：Reagent A 80 µL，Cas9 蛋白 1.6 µg，sgRNA 0.6 µg，Reagent B 2.8 µL，細(xì)胞數(shù) 2×10? - 4×10?（40 µL 懸液）。

• 24 孔板：Reagent A 200 µL，Cas9 蛋白 4 µg，sgRNA 1.5 µg，Reagent B 7 µL，細(xì)胞數(shù) 4×10? - 1×10?（100 µL 懸液）。

• 12 孔板：Reagent A 600 µL，Cas9 蛋白 7.5 µg，sgRNA 4.5 µg，Reagent B 21 µL，細(xì)胞數(shù) 1×10? - 3×10?（300 µL 懸液）。

• 6 孔板：Reagent A 800 µL，Cas9 蛋白 16 µg，sgRNA 6 µg，Reagent B 28 µL，細(xì)胞數(shù) 2×10? - 4×10?（400 µL 懸液）。

備注：大體系（≥600 µL）需在離心管中渦旋混勻后孵育。

數(shù)據(jù)分享

使用 Human TRAC-sgRNA 陽(yáng)性對(duì)照轉(zhuǎn)染 Jurkat 細(xì)胞后，72 小時(shí)檢測(cè) TRAC 基因編輯效率：

• 測(cè)序分析（圖 1）：靶點(diǎn)基因編輯比例為 63.4%（PCR 引物：正向 GCAGTATTATTATTAAGTAGCCCT，反向 AACAAGGCTCACTGTTTTCTT）。

• 統(tǒng)計(jì)結(jié)果（圖 2）：陽(yáng)性對(duì)照組平均編輯效率為 63.9%。

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